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Jun 25, 2023

La restriction conformationnelle façonne l’inhibition d’une protéine adaptatrice d’efflux multidrogue

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 3900 (2023) Citer cet article 1884 Accès 182 Détails d'Altmetric Metrics Les pompes à efflux membranaires jouent un rôle majeur dans la multirésistance bactérienne aux médicaments.

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 3900 (2023) Citer cet article

1884 Accès

182 Altmétrique

Détails des métriques

Les pompes à efflux membranaires jouent un rôle majeur dans la multirésistance bactérienne. Le système tripartite de pompe à efflux multidrogue d'Escherichia coli, AcrAB-TolC, est une cible d'inhibition visant à réduire le développement de résistance et à restaurer l'efficacité des antibiotiques, avec des homologues d'autres agents pathogènes ESKAPE. Ici, nous rationalisons un mécanisme d’inhibition contre la protéine adaptatrice périplasmique, AcrA, en utilisant une combinaison de spectrométrie de masse par échange hydrogène/deutérium, d’essais d’efflux cellulaire et de simulations de dynamique moléculaire. Nous définissons la dynamique structurelle d'AcrA et constatons qu'un inhibiteur peut infliger une stabilisation à longue portée dans ses quatre domaines, alors qu'un substrat d'efflux en interaction a un effet minimal. Nos résultats soutiennent un modèle dans lequel un inhibiteur forme un coin moléculaire dans une fente entre les domaines lipoyle et αβ de AcrA, diminuant ainsi sa transmission conformationnelle des signaux évoqués par le médicament d'AcrB à TolC. Ce travail fournit des informations moléculaires sur la fonction de la protéine adaptatrice multidrogue qui pourraient être utiles pour le développement de thérapies antimicrobiennes.

La multirésistance fait référence à la capacité des bactéries pathogènes à survivre à des doses mortelles provenant de nombreux composés structurellement divers1. La multirésistance bactérienne continue de se propager à un rythme alarmant, menaçant la santé humaine à l’échelle mondiale. En 2019, la multirésistance bactérienne aux médicaments a directement causé 1,27 million de décès dans le monde, soit plus que le VIH et le paludisme réunis2.

L’activité des pompes à efflux est un mécanisme majeur de la multirésistance aux médicaments3,4. Les pompes à efflux sont généralement surexprimées en réponse à une exposition aux antibiotiques et peuvent exporter un large éventail de composés chimiquement divers, réduisant ainsi la concentration intracellulaire d'antibiotiques et conférant une résistance aux médicaments1. La famille de transporteurs hydrophobes et amphiphiles de nodulation et de division cellulaire (HAE-RND) joue un rôle clé dans la multirésistance bactérienne. Escherichia coli AcrAB-TolC est le membre prototypique de cette famille avec des homologues d'autres bactéries ESKAPE à Gram négatif5,6,7. Il s'agit d'un complexe protéique tripartite qui traverse l'enveloppe membranaire des bactéries à Gram négatif, où AcrB est le transporteur membranaire interne du complexe, AcrA la protéine adaptatrice périplasmique (PAP) de la famille de protéines Membrane Fusion Protein (MFP) et TolC. le canal de la membrane externe (Fig. 1a). Dynamisé par la force motrice des protons, AcrB transporte les substrats, y compris les antibiotiques, de l'environnement intracellulaire vers l'extérieur de la cellule, à travers un canal scellé formé par AcrA et TolC (Fig. 1a) 8,9.

un schéma du complexe AcrAB-TolC intégré dans l'enveloppe cellulaire. LPS Lipopolysaccharide. b Structure d'AcrA isolée de l'ensemble du complexe AcrAB-TolC (PDB: 5O66) 23. c Trois constructions d'AcrA. AcrAL contient du Cys25 qui est lipidé après le clivage du peptide signal 1-24. AcrAS contient une mutation Cys25Met et manque donc de lipidation et de peptide signal. AcrASD contient deux séquences AcrAS connectées par un éditeur de liens TRRIT. d Caractérisation par MS native des constructions AcrA à pH 6,0. Le tampon protéique a été échangé dans un tampon acétate d'ammonium 100 mM avant la MS. AcrAL nécessitait la présence d'une concentration micellaire critique (CMC) 2 × de DDM à 0,03 %. AcrAL se présente comme un mélange de monomères et de dimères, AcrAS comme monomères et AcrASD comme dimère. Les spectres collectés sur des répliques biologiques et par deux systèmes MS natifs différents, un système de temps de vol et un système orbitrap, donnent l'assurance que ces signatures spectrales ne sont pas des artefacts de préparation de protéines ou de détection MS67. Les enveloppes marquées d'un astérisque (*) représentent l'état de charge le plus élevé, indicateur d'un désordre intrinsèque. Masses trouvées dans le tableau supplémentaire 1.

Des efforts ont été déployés pour développer des inhibiteurs de pompe à efflux (IPE) contre ces systèmes afin de « relancer » les activités de divers antibiotiques préexistants, auxquels une population bactérienne est devenue résistante10. Jusqu’à présent, l’objectif était de générer des EPI ciblant le transporteur AcrB lui-même. Cependant, les EPI précédemment identifiés n’ont pas réussi à passer aux essais cliniques, en raison de problèmes de toxicité et de la nature confuse de l’AcrB pour transporter ses inhibiteurs11,12. Il est donc nécessaire d’explorer d’autres voies pour générer des PEV réussis, l’AcrA apparaissant comme une cible potentielle d’inhibition10,13. Récemment, NSC 60339 a été identifié comme inhibiteur d’AcrA grâce à un criblage expérimental et informatique conjoint10. Des travaux antérieurs suggéraient que NSC 60339 pourrait provoquer un changement de conformation dans AcrA et proposaient un possible site de liaison à l'interface entre les domaines lipoyl et αβ Barrel, appelé site IV (Fig. 1b) 10,14. De plus, il a récemment été démontré que AcrA a des fonctions plus diverses, étant identifié comme un « signal nécrologique » bactérien au sein des essaims d'E. coli15 : lorsqu'une sous-population de l'essaim meurt, les cellules mortes libèrent le signal nécrA AcrA, qui lie TolC à l'extérieur des autres cellules vivantes, stimulant l’efflux dans la zone affectée et la régulation positive de diverses pompes d’efflux16. Il est intéressant de noter que des travaux récents ont également montré que NSC 60339 peut inhiber la capacité de nécrosignalisation médiée par AcrA16. Comprendre les mécanismes moléculaires de l’inhibition de l’AcrA est donc important pour la future découverte de médicaments pour le PEV et la nécrosignalisation. Cependant, le mécanisme d’inhibition de l’AcrA reste insaisissable.